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Mar 21, 2023

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Band Nature Communications

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4902 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Ein Lab-on-a-Chip-System mit Point-of-Care-Testfunktion bietet schnelles und genaues Diagnosepotenzial und ist in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen nützlich, in denen biomedizinische Ausrüstung und qualifiziertes Fachpersonal nicht ohne weiteres verfügbar sind. Ein Point-of-Care-Testsystem, das gleichzeitig über alle erforderlichen Funktionen der multifunktionalen Abgabe, der bedarfsgesteuerten Freigabe, des robusten Betriebs und der Fähigkeit zur Langzeitlagerung von Reagenzien verfügt, ist jedoch immer noch eine große Herausforderung. Hier beschreiben wir eine durch Filmhebel betätigte Schaltertechnologie, die Flüssigkeiten in jede Richtung manipulieren kann, eine genaue und proportionale Freigabereaktion auf den angelegten pneumatischen Druck bietet und auch bei abrupten Bewegungen und Vibrationen robust bleibt. Basierend auf der Technologie beschreiben wir auch die Entwicklung eines Polymerase-Kettenreaktionssystems, das die Funktionen Einführung, Mischen und Reaktion von Reagenzien in einem Prozess integriert und eine „Probe-in-Antwort-aus“-Leistung für alle klinischen Nasenproben von 18 Patienten erreicht Influenza und 18 Einzelkontrollen, in guter Übereinstimmung der Fluoreszenzintensität mit der Standard-Polymerase-Kettenreaktion (Pearson-Koeffizienten > 0,9). Die vorgeschlagene Plattform verspricht eine robuste Automatisierung der biomedizinischen Analyse und kann somit die Kommerzialisierung einer Reihe von Point-of-Care-Testgeräten beschleunigen.

Neu auftretende menschliche Krankheiten, wie die COVID-19-Pandemie im Jahr 2020, die zum Verlust von Millionen von Menschenleben geführt hat, stellen eine große Bedrohung für die globale Gesundheit und die menschliche Zivilisation dar1. Eine frühzeitige, schnelle und genaue Erkennung von Krankheiten ist entscheidend für die Kontrolle der Ausbreitung eines Virus und für die Erzielung verbesserter Behandlungsergebnisse. Mainstream-Diagnose-Ökosysteme, die auf zentralisierten Laboren basieren, in denen Testproben an Krankenhäuser oder Diagnosekliniken geschickt und von professionellem Personal betrieben werden, schränken den Zugang derzeit für fast 5,8 Milliarden Menschen weltweit ein, insbesondere für diejenigen, die in ressourcenarmen Gegenden leben, in denen es an teurer biomedizinischer Ausrüstung mangelt und qualifizierte Ärzte2. Die Entwicklung eines kostengünstigen und benutzerfreundlichen Lab-on-a-Chip-Systems mit Point-of-Care-Testing (POCT)-Fähigkeit, das Ärzten zeitnahe Diagnoseinformationen liefert, um fundierte Entscheidungen bezüglich Diagnose und Behandlung zu treffen, ist daher äußerst wünschenswert3.

In den Richtlinien der Weltgesundheitsorganisation (WHO) heißt es, dass ein idealer POCT erschwinglich, benutzerfreundlich (einfache Anwendung mit minimalem Schulungsaufwand), genau (falsch-negative oder falsch-positive Ergebnisse vermeiden), schnell und robust (sichert eine gute Reproduzierbarkeit) sein muss. und lieferbar (langfristig speicherbar und für Endbenutzer leicht erhältlich)4. Um diese Anforderungen zu erfüllen, sollten POCT-Systeme die folgenden Funktionen bieten: multifunktionale Abgabe zur Reduzierung manueller Eingriffe, bedarfsgesteuerte Freigabe zur proportionalen Steuerung des Reagenzientransports für genaue Testergebnisse und robuste Abläufe, um Vibrationen aus der Umgebung standzuhalten. Die derzeit am häufigsten verwendeten POCT-Geräte sind Lateral-Flow-Streifen5,6, die aus mehreren Schichten poröser Nitrozellulosemembranen bestehen, die sehr kleine Probenmengen vorwärts treiben und dabei über eine Kapillarkraft auf vorimmobilisierte Reagenzien reagieren. Obwohl sie kostengünstig und einfach zu bedienen sind und den Vorteil schneller Ergebnisse bieten, können die auf Flow-Strips basierenden POCT-Geräte nur für Bioassays (z. B. Glukosespiegeltest7,8 und Schwangerschaftstest9,10) eingesetzt werden, ohne dass mehrstufige Reaktionen erforderlich sind (z. B. Laden mehrerer Reagenzien, Mischen, Multiplex-Reaktion). Darüber hinaus bietet die treibende Kraft zur Steuerung der Flüssigkeitsbewegung (d. h. die Kapillarkraft) keine gute Kohärenz, insbesondere zwischen verschiedenen Chargen, was zu einer schlechten Reproduzierbarkeit11 führt und die Lateral-Flow-Streifen vor allem für qualitative Nachweise nützlich macht12,13.

Fortschrittliche Fertigungskapazitäten im Mikro- und Nanomaßstab haben Möglichkeiten für die Entwicklung mikrofluidischer POCT-Geräte für quantitative Messungen geschaffen14,15,16,17. Durch Abstimmung der Grenzflächeneigenschaften18,19 und der Geometrie der Kanäle20,21,22 können die Kapillarkraft und die Durchflussrate dieser Geräte gesteuert werden. Ihre Robustheit, insbesondere bei stark benetzenden Flüssigkeiten, ist jedoch aufgrund ihrer Herstellungsungenauigkeit, Materialmängel und Anfälligkeit gegenüber Umgebungsvibrationen immer noch nicht akzeptabel23. Da der Kapillarfluss außerdem an der Flüssigkeits-Luft-Grenzfläche erzeugt wird, können keine zusätzlichen Strömungen eingeführt werden, insbesondere nachdem die Mikrofluidikkanäle mit Flüssigkeit gefüllt sind. Infolgedessen müssen mehrere Probeneinführungsschritte durchgeführt werden, um einen komplexeren Test zu erreichen24,25.

Unter den mikrofluidischen Geräten stellt das zentrifugale mikrofluidische Gerät derzeit eine der besten POCT-Lösungen dar26,27. Der Antriebsmechanismus ist vorteilhaft, da durch die Einstellung der Drehfrequenz die Betätigungskräfte gesteuert werden können. Der Nachteil besteht jedoch darin, dass die Zentrifugalkraft immer auf den Außenrand des Geräts gerichtet ist, was zu Schwierigkeiten bei der Durchführung mehrstufiger Reaktionen führt, die für komplexere Tests erforderlich sind. Auch wenn zusätzlich zur Zentrifugalkraft zusätzliche Betätigungskräfte (z. B. Kapillare28,29 und viele andere30,31,32,33,34,35) eingebracht werden, um die multifunktionale Abgabe zu erreichen, kann es aufgrund dieser zusätzlichen Kräfte dennoch zu einem unbeabsichtigten Flüssigkeitstransport kommen Meistens liegen sie um Größenordnungen unter den Zentrifugalkräften, sodass sie nur in kleinen Betriebsbereichen wirksam sind oder nicht für die bedarfsgesteuerte Flüssigkeitsfreisetzung geeignet sind. Die Kombination pneumatischer Vorgänge in der zentrifugalen Mikrofluidik, z. B. der zentrifugodynamischen Methode36,37,38, der thermopneumatischen Methode39 und der aktiven pneumatischen Methode40, hat sich als attraktive Alternative erwiesen. Bei der kontrifugodynamischen Methode sind ein zusätzlicher Hohlraum und verbindende Mikrokanäle in das Gerät integriert, um Manipulationen sowohl nach außen als auch nach innen zu ermöglichen. Die Pumpeffizienz (zwischen 75 und 90 %) hängt jedoch stark von der Anzahl der Pumpzyklen sowie der Viskosität ab der Flüssigkeiten. Bei der thermopneumatischen Methode wurden eine Latexmembran und eine Flüssigkeitsübergangskammer speziell entwickelt, um einen Einlass abzudichten oder wieder zu öffnen, wenn ein eingeschlossenes Luftvolumen erhitzt oder abgekühlt wird. Der Heiz-/Kühlaufbau führt jedoch zu einem langsamen Betätigungsproblem und schränkt seine Verwendung in wärmeempfindlichen Assays (z. B. Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Amplifikation) ein. Bei der aktiven pneumatischen Methode werden die bedarfsgesteuerte Flüssigkeitsabgabe und die Manipulation nach innen durch die gleichzeitige Anwendung von Überdruck und einer genau abgestimmten Rotationsgeschwindigkeit erreicht, die durch einen Hochgeschwindigkeitsmotor ermöglicht wird. Es gab andere erfolgreiche Methoden, die nur pneumatische Antriebsmechanismen (Überdruck41,42 oder Unterdruck43) und eine normalerweise geschlossene Ventilstruktur verwendeten. Durch sequenzielles Anlegen von Druck in der pneumatischen Kammer wird die Flüssigkeit peristaltisch nach vorne gepumpt, wodurch das normalerweise geschlossene Ventil verhindert, dass die Flüssigkeit zurückfließt, wodurch komplexe Flüssigkeitsmanipulationen ermöglicht werden. Derzeit gibt es jedoch nur begrenzte mikrofluidische Technologien, die eine komplexe Flüssigkeitshandhabung in einem einzigen POCT-Gerät durchführen können, einschließlich multifunktionaler Abgabe, bedarfsgesteuerter Freisetzung, robustem Betrieb, Langzeitlagerung, Handhabung hochviskoser Flüssigkeiten und kosteneffizienter Herstellung -alles zur selben Zeit. Ein Mangel an mehrstufiger Funktionalität könnte auch einer der Gründe dafür sein, dass bisher nur wenige kommerzielle POCT-Produkte (z. B. Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat und Rhonda) erfolgreich auf dem freien Markt eingeführt wurden.

In diesem Artikel stellten wir eine Art pneumatischen mikrofluidischen Antriebsmechanismus vor, der auf einer filmhebelbetätigten Schaltertechnologie (FAST) basiert. FAST verfügt gleichzeitig über alle notwendigen Eigenschaften und ist in der Lage, eine Reihe von Reagenzien zu verarbeiten, vom Mikroliter bis zu mehreren Millilitern. FAST besteht aus einer elastischen Folie, einem Hebel und einem Block. Wenn kein pneumatischer Druck ausgeübt wird, können Folie, Hebel und Block dicht verschlossen und die Flüssigkeit im Inneren über einen längeren Zeitraum gelagert werden. Wenn ein entsprechender, auf die Länge des Hebels abgestimmter Druck ausgeübt wird, dehnt sich die Folie aus und drückt den Hebel auf, damit die Flüssigkeit hindurchfließen kann. Dies ermöglicht eine multifunktionale Flüssigkeitsabgabe auf kaskadierte, gleichzeitige, sequentielle oder selektive Weise.

Wir haben ein PCR-System mit FAST entwickelt, um „Sample-in-Answer-out“-Ergebnisse für den Nachweis von Influenza-A- und -B-Viren (IAV und IBV) zu erzielen. Wir erreichten eine untere Nachweisgrenze (LOD) von 102 Kopien/ml und unsere Multiplex-Tests zeigten Spezifität für IAV und IBV und ermöglichten die Pathotypisierung des Influenzavirus. Die klinischen Testergebnisse unter Verwendung der Nasenabstrichprobe von 18 Patienten und 18 gesunden Personen zeigen eine gute Übereinstimmung der Fluoreszenzintensität mit der Standard-RT-PCR (Pearson-Koeffizienten > 0,9). Die geschätzten Materialkosten des FAST-POCT-Geräts belaufen sich auf etwa 1 US-Dollar (Ergänzungstabelle 1), die bei Verwendung einer Massenfertigungsmethode (z. B. Formspritzen) weiter gesenkt werden können. In der Praxis verfügt das FAST-basierte POCT-Gerät über alle von der WHO vorgesehenen erforderlichen Eigenschaften und ist mit neuen biochemischen Testmethoden wie dem plasmonischen Thermozyklustest44, dem amplifikationsfreien Immunoassay45 und dem Nanokörper-funktionalisierten Test46 kompatibel, was Chancen für POCT-Systeme eröffnet .

Abbildung 1a zeigt die Struktur einer FAST-POCT-Plattform, die aus vier Fluidkammern besteht: der Vorspeicherkammer, der Mischkammer, der Reaktionskammer und der Abfallkammer. Ein wichtiger Faktor zur Steuerung des Flüssigkeitsflusses ist die FAST-Struktur (bestehend aus einer elastischen Folie, einem Hebel und einem Block), die sich an der Vorspeicher- und Mischkammer befindet. Als pneumatisch angetriebene Methode ermöglicht die FAST-Struktur eine genaue Steuerung des Flüssigkeitsflusses, einschließlich des Wechsels zwischen dem versiegelten und geöffneten Zustand, einer multifunktionalen Abgabe, einer bedarfsgesteuerten Flüssigkeitsabgabe, einem robusten Betrieb (z. B. unempfindlich gegenüber Umgebungsvibrationen) und einer langfristigen Funktion Lagerung. Die FAST-POCT-Plattform besteht aus vier Schichten – Substratschicht, elastische Filmschicht, Kunststofffilmschicht und Deckschicht – wie in einer erweiterten Ansicht in Abb. 1b zu sehen ist (auch detailliert in den ergänzenden Abbildungen S1 und S2). Alle Flüssigkeitstransportkanäle und -kammern (z. B. Vorspeicher- und Reaktionskammern) sind auf dem Substrat aus PLA (Polymilchsäure) mit einer Dicke von 0,2 mm (dünnster Teil) bis 5 mm integriert. Das elastische Folienmaterial ist PDMS mit einer Dicke von 300 μm und lässt sich aufgrund seiner „dünnen Dicke“ und seines kleinen Elastizitätsmoduls (ca. 2,25 MPa47) bei Anwendung von Luftdruck leicht ausdehnen. Die Kunststofffolienschicht besteht aus Polyethylenterephthalat (PET) mit einer Dicke von 100 μm und dient dazu, die elastische Folie vor übermäßiger Verformung durch pneumatischen Druck zu schützen. Korrespondierend zu den Kammern auf der Substratschicht befinden sich Hebel, die über Scharniere mit der Deckschicht (aus PLA) verbunden sind, um den Flüssigkeitsfluss zu steuern. Die elastische Folie wird mit einem doppelseitigen Klebeband (ARseal 90880) auf der Trägerschicht verklebt und mit der Kunststofffolie abgedeckt. In der Deckschicht werden T-förmige Clipstrukturen eingesetzt, um die drei Schichten auf dem Substrat zusammenzufügen. Der T-förmige Clip hat einen Abstand zwischen zwei Beinen. Wenn der Clip in die Nut gedrückt wird, biegen sich die beiden Schenkel leicht und kehren dann beim Durchtreten durch die Nut in ihren ursprünglichen Zustand zurück und verbinden die Abdeckung und den Untergrund fest (ergänzende Abbildung S1). Mithilfe eines Verbindungsstücks werden dann die vier Schichten zusammengefügt.

a Schematische Darstellung der Plattform mit Darstellung verschiedener Funktionskammern und der Merkmale von FAST. b Erweiterte schematische Darstellung der FAST-POCT-Plattform. c Foto der Plattform neben einer US-Viertelmünze.

Der Funktionsmechanismus der FAST-POCT-Plattform ist in Abb. 2 dargestellt. Die Schlüsselkomponenten sind ein Block auf der Substratschicht und ein Scharnier auf der Deckschicht, was zu einer Presspassung führt, wenn die vier Schichten durch das T-Stück zusammengesetzt werden. geformte Clipstrukturen. Wenn kein pneumatischer Druck angelegt wird (Abb. 2a), führt die Presspassung zu einer Biegeverformung des Scharniers, wodurch die Dichtungskräfte über den Hebel ausgeübt werden, um die elastische Folie gegen den Block zu drücken und die Flüssigkeit in der Kammer abzudichten als versiegelter Zustand definiert. Es ist zu beachten, dass sich der Hebel in diesem Zustand nach außen biegt, wie in der Seitenansicht in Abb. 2a zu sehen ist. Beim Anlegen des pneumatischen Drucks (Abb. 2b) dehnt sich die elastische Folie nach außen bis zur Deckschicht aus und drückt den Hebel nach oben; Somit öffnet sich zwischen dem Hebel und dem Block ein Spalt, der es der Flüssigkeit ermöglicht, zur nächsten Kammer zu fließen, was als geöffneter Zustand definiert ist. Wenn der pneumatische Druck entfernt wird, kann der Hebel aufgrund der elastischen Eigenschaft der Scharniere in seine ursprüngliche Position zurückkehren und in seinem abgedichteten Zustand bleiben. Das Video der Bewegung des Hebels finden Sie im Zusatzfilm S1.

Schematische Darstellungen und Bilder für einen versiegelten Zustand. Wenn kein Druck ausgeübt wird, drücken die Hebel die Folie an die Blöcke und die Flüssigkeit wird versiegelt. b Geöffneter Zustand. Bei Druck dehnt sich die Folie aus und drückt den Hebel nach oben, wodurch sich der Kanal öffnet und die Flüssigkeit abfließen kann. c Charakteristische Größen, die den kritischen Druck bestimmen. Zu den charakteristischen Größen gehören die Länge des Hebels (L), der Abstand zwischen Block und Scharnier (l) und die Dicke des Hebelvorsprungs (t). Fs ist die Dichtkraft am Blockpunkt B. q ist eine gleichmäßig verteilte Belastung des Hebels. Tx* bezeichnet das durch den Hebel erzeugte Drehmoment am Scharnier. Unter kritischem Druck versteht man den Druck, der erforderlich ist, um den Hebel nach oben zu drücken und die Flüssigkeit zum Fließen zu bringen. d Die theoretischen und experimentellen Ergebnisse zum Zusammenhang zwischen dem kritischen Druck und den charakteristischen Größen. n = 6 unabhängige Experimente wurden mit den als ± sd angezeigten Daten durchgeführt. Die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Ein auf der Balkentheorie basierendes analytisches Modell wird wie folgt entwickelt, um den kritischen Druck Pc, bei dem ein Spalt geöffnet wird, als Funktion der geometrischen Parameter (z. B. L ist die Hebellänge, l ist der Abstand zwischen Block und Scharnier) zu analysieren , S ist die Kontaktfläche des Hebels mit der Flüssigkeit und t ist die Vorsprungsdicke des Hebels (siehe Abb. 2c). Wie in der Ergänzenden Anmerkung und der Ergänzenden Abbildung S3 beschrieben, öffnet sich eine Lücke, wenn \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), wobei Fs die Dichtung ist Kraft im Zusammenhang mit der Presspassung und leitet das Drehmoment \({T}_{x}^{\ast }(={F}_{s}l)\), das durch die Biegeverformung des Scharniers erzeugt wird. Experimentelle Charakterisierungen und analytische Modelle zeigen eine gute Übereinstimmung (Abb. 2d), was zeigt, dass der kritische Druck Pc mit zunehmendem t/l und abnehmendem L zunimmt, was leicht durch das klassische Balkenmodell erklärt werden kann, d. h. das Drehmoment steigt mit t /l. Unsere theoretische Analyse zeigt somit deutlich, dass der kritische Druck durch Anpassung der Hebellänge L und des t/l-Verhältnisses effektiv eingestellt werden kann, und stellt somit eine wichtige Grundlage für das Design der FAST-POCT-Plattform dar.

Die FAST-POCT-Plattform ermöglicht eine multifunktionale Abgabe (wie in Abb. 3a mit Abbildungen und Experimenten dargestellt), was das wichtigste Merkmal für einen erfolgreichen POCT ist, bei dem die Flüssigkeit in jede Richtung und in beliebiger Reihenfolge entweder kaskadierend, gleichzeitig oder sequentiell manipuliert werden kann oder selektive Multifunktionsdosierung. Abbildung 3a(i) zeigt den kaskadierten Abgabemodus, bei dem zwei oder mehr Kammern kaskadiert miteinander verbunden sind, wobei die Blöcke zur Trennung der verschiedenen Reagenzien und ein Hebel zur Steuerung des offenen und geschlossenen Zustands verwendet werden. Bei Druckbeaufschlagung fließt die Flüssigkeit kaskadenförmig von der oberen in die untere Kammer. Es ist zu beachten, dass die kaskadierten Kammern mit Nasschemikalien oder Trockenchemikalien wie lyophilisierten Pulvern gefüllt werden können. Im Experiment in Abb. 3a(i) floss die rote Tinte aus der oberen Kammer mit blauen Farbstoffpulvern (Kupfersulfat) in die zweite Kammer und wurde dunkelblau, als sie die untere Kammer erreichte. Hier wird auch der Steuerdruck zur eingespritzten Flüssigkeit angezeigt. Wenn ein Hebel mit zwei Kammern verbunden ist, wird in ähnlicher Weise der gleichzeitige Injektionsmodus aktiviert, wie in Abb. 3a(ii) gezeigt, bei dem die Flüssigkeit bei Anwendung eines Drucks gleichmäßig auf zwei oder mehr Kammern verteilt werden kann. Da der kritische Druck von der Länge des Hebels abhängt, kann man die Hebellänge anpassen, um einen sequentiellen Injektionsmodus zu erreichen, wie in Abb. 3a(iii) dargestellt. Ein langer Hebel (mit kritischem Druck Pc_long) war mit Kammer B verbunden und ein kurzer Hebel (mit kritischem Druck Pc_short > Pc_long) war mit Kammer A verbunden. Da Druck P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) angelegt wurde, war nur die Flüssigkeit in Rot kann in Kammer B fließen, und wenn der Druck auf P2 (> Pc_short) erhöht wurde, kann die blaue Flüssigkeit in Kammer A fließen. Dieser sequentielle Injektionsmodus gilt für verschiedene Flüssigkeiten, die nacheinander in die zugehörigen Kammern übertragen werden, was für einen erfolgreichen POCT von entscheidender Bedeutung ist Gerät. Abbildung 3a(iv) zeigt den selektiven Injektionsmodus, bei dem die Hauptkammer einen kurzen (mit kritischem Druck Pc_short) und einen langen Hebel (mit kritischem Druck Pc_long < Pc_short) hatte, die zusätzlich mit Kammer A bzw. Kammer B verbunden waren zu einem anderen Luftkanal, der mit Kammer B verbunden ist. Um die Flüssigkeit zunächst in Kammer A zu übertragen, wurden gleichzeitig Druck P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) und P2 (P2 > P1) mit P1 + P2 > Pc_short auf das Gerät ausgeübt. Auf diese Weise wurde durch P2 verhindert, dass die Flüssigkeit in Kammer B eindringt; In der Zwischenzeit überschritt der Gesamtdruck P1 + P2 den kritischen Druck, um den kürzeren Hebel zu aktivieren, der mit Kammer A verbunden ist, damit die Flüssigkeit in Kammer A fließen kann. Wenn dann Kammer B gefüllt werden musste, müssen wir nur P1 anwenden (Pc_long < P1 < Pc_short) in der Hauptkammer, um den langen Hebel zu aktivieren und die Flüssigkeit in Kammer B fließen zu lassen. Vom Zeitpunkt t = 3 s bis 9 s ist deutlich zu beobachten, dass die Flüssigkeit in Kammer A konstant blieb, während sie in Kammer zunahm B, wenn der Druck P1 angelegt wurde. Wenn Kammer A erneut gefüllt werden muss, müssen wir nur P1 in der Hauptkammer und P2 in der Zusatzkammer auftragen. Dadurch kann das Strömungsverhalten gezielt zwischen den Kammern A und B wechseln. Das Strömungsverhalten der vier multifunktionalen Dosiermodi finden Sie im Zusatzfilm S2.

a Darstellung der multifunktionalen Abgabe, nämlich (i) kaskadierte, (ii) gleichzeitige, (iii) sequentielle und (iv) selektive Abgabe. Die Kurven geben den Arbeitsablauf und die Parameter dieser vier Dosiermodi an. b Die Ergebnisse der Langzeitlagerungstests von entionisiertem Wasser und Ethanol. n = 5 unabhängige Experimente wurden mit den als ± sd c angezeigten Daten durchgeführt. Demonstration der Robustheitstests, wenn sich das FAST-Gerät und das Kapillarventil (CV)-basierte Gerät in (i) statischem Zustand und (ii) vibrierendem Zustand befinden. (iii) Das Volumen gegenüber der Zeit für FAST- und CV-Geräte bei unterschiedlichen Winkelschwingungsfrequenzen. d Ergebnisse für On-Demand-Freigabetests von (i) FAST-Gerät und (ii) CV-Gerät. (iii) Die Beziehung zwischen Volumen und Zeit für FAST- und CV-Geräte, die einen intermittierenden Druckmodus verwenden. Alle Maßstabsbalken 1 cm. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die langfristige Aufbewahrung von Reagenzien ist ein weiteres wesentliches Merkmal eines erfolgreichen POCT-Geräts, das es ungeschultem Personal ermöglicht, mit mehreren Reagenzien umzugehen. Obwohl viele Techniken ihr Potenzial für die Langzeitlagerung zeigen (z. B. Mikrospender35, Blisterverpackungen48 und Stickverpackungen49), ist eine spezielle Aufnahmekammer zur Aufnahme der Verpackungen erforderlich, was die Kosten und die Komplexität erhöht. Darüber hinaus ermöglichen diese Speichermechanismen keine bedarfsgesteuerte Freigabe und führen zum Verlust von Reagenzien aufgrund von Rückständen in den Verpackungen. Die Fähigkeit zur Langzeitlagerung wurde durch die Durchführung beschleunigter Lebensdauertests getestet, wobei PMMA-Material verwendet wurde, das aufgrund seiner geringen Rauheit und des Widerstands gegen Gaspermeation mit der CNC-Technik hergestellt wurde (ergänzende Abbildung S5). Die Testgeräte wurden 9 Tage lang bei 65 °C mit entionisiertem Wasser und 70 % Ethanol (zur Simulation der flüchtigen Reagenzien) gefüllt. Sowohl entionisiertes Wasser als auch Ethanol wurden unter Verwendung einer Aluminiumfolie gelagert, um ihren oberen Eingang abzudichten. Zur Berechnung der äquivalenten Echtzeit wurden eine Arrhenius-Gleichung und die in der Literatur50,51 angegebene Aktivierungsenergie für die Permeation angewendet. Abbildung 3b zeigt die Ergebnisse des durchschnittlichen Gewichtsverlusts von fünf Proben, die 9 Tage lang bei 65 °C gehalten wurden, d. h. 0,30 % für entionisiertes Wasser und 0,72 % für 70 %iges Ethanol über einen Zeitraum von 2 Jahren bei 23 °C.

Abbildung 3c zeigt die Robustheitsprüfung unter Vibration. Da das Kapillarventil (CV) die beliebteste Flüssigkeitsmanipulationstechnik in bestehenden POCT-Geräten28,29 ist, wird zum Vergleich ein CV-Gerät mit einer Breite von 300 μm und einer Tiefe von 200 μm verwendet. Es wurde beobachtet, dass, wenn beide Geräte still gehalten wurden, die Flüssigkeit in der FAST-POCT-Plattform versiegelt wurde und die Flüssigkeit für das CV-Gerät aufgrund der abrupten Erweiterung des Kanals festgehalten wurde, was die Kapillarkraft verringerte. Als jedoch die Winkelschwingungsfrequenz des Orbitalschüttlers zunahm, blieb die Flüssigkeit in der FAST-POCT-Plattform versiegelt, aber die Flüssigkeit im CV-Gerät floss in die untere Kammer (siehe auch im Zusatzfilm S3). Dies deutet darauf hin, dass das deformierte Scharnier in der FAST-POCT-Plattform eine starke mechanische Kraft auf den Block ausüben und so die Flüssigkeit in der Kammer dicht verschließen kann. Beim CV-Gerät wird die Flüssigkeit jedoch aufgrund des Gleichgewichts zwischen den Phasen Feststoff, Luft und Flüssigkeit festgehalten, wodurch Instabilität entsteht und die Gefahr besteht, dass die Vibration das Gleichgewicht stört und zu einem unbeabsichtigten Fließverhalten führt. Der Vorteil der FAST-POCT-Plattform besteht darin, dass sie eine robuste Funktion bietet und Betriebsausfälle bei Vibrationen vermeidet, die typischerweise während der Lieferung und des Betriebs auftreten.

Ein weiteres wichtiges Merkmal der FAST-POCT-Plattform ist ihre On-Demand-Release-Leistung, die eine entscheidende Anforderung bei der quantitativen Analyse darstellt. Abbildung 3d vergleicht die On-Demand-Version sowohl für die FAST-POCT-Plattform als auch für ein CV-Gerät. Aus Abb. 3d(iii) sehen wir, dass das FAST-Gerät schnell auf das Drucksignal reagiert. Als der Druck auf eine FAST-POCT-Plattform ausgeübt wurde, floss die Flüssigkeit; Der Fluss stoppte sofort, sobald der Druck entfernt wurde (Abb. 3d (i)). Dieser Vorgang ist auf die schnelle elastische Erholung des Scharniers zurückzuführen, das den Hebel zurück zum Block drückt und so die Kammer abdichtet. Im CV-Gerät fließt die Flüssigkeit jedoch weiter, was am Ende zu einem unbeabsichtigten Flüssigkeitsvolumen von etwa 100 μl führt, wenn der Druck entfernt wird (Abb. 3d (ii) und Zusatzfilm S4). Dies kann auf das Verschwinden des kapillaren Pinning-Effekts bei vollständiger Benetzung des CV nach der ersten Injektion zurückgeführt werden.

Die Fähigkeit, Flüssigkeiten mit unterschiedlicher Benetzbarkeit und Viskosität in demselben Gerät zu handhaben, stellt für die POCT-Anwendung immer noch eine Herausforderung dar. Eine geringe Benetzbarkeit kann zu Undichtigkeiten oder einem anderen unbeabsichtigten Fließverhalten im Kanal führen und die Zubereitung hochviskoser Flüssigkeiten erfordert oft Hilfsgeräte wie Vortex-Mischer, Zentrifugen und Siebe52. Wir haben die Beziehung zwischen dem kritischen Druck und den Flüssigkeitseigenschaften (mit einem breiten Spektrum an Benetzbarkeit und Viskosität) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und Film S5 dargestellt. Es ist ersichtlich, dass alle Flüssigkeiten mit unterschiedlicher Benetzbarkeit und Viskosität dicht in der Kammer eingeschlossen werden können, und wenn der Druck ausgeübt wird, können sogar Flüssigkeiten mit einer Viskosität von bis zu 5500 cP in die nächste Kammer überführt werden, was dies erleichtert Prüfung von hochviskosen Proben (z. B. Sputum, eine hochviskose Probe zur Diagnose von Atemwegserkrankungen) möglich.

Durch die Kombination der oben genannten multifunktionalen Dosiereinheit kann eine breite Palette an FAST-basierten POCT-Geräten entwickelt werden. Wir haben ein Beispiel gezeigt, wie in Abb. 1 gezeigt. Diese Einheit enthält Vorlagerkammern, Mischkammer, Reaktionskammer und eine Abfallkammer. Die Reaktionsreagenzien können in den Vorlagerkammern langfristig gelagert und anschließend in die Mischkammer abgegeben werden. Die gemischten Reagenzien können bei Anwendung des richtigen Drucks selektiv in die Abfallkammer oder Reaktionskammer überführt werden.

Da PCR-Tests der Goldstandard für den Nachweis von Krankheitserregern (z. B. H1N1 und COVID-19) sind und mehrere Reaktionsschritte umfassen, haben wir als Anwendung die FAST-POCT-Plattform für PCR-Tests genutzt. Abbildung 4 zeigt das PCR-Testverfahren mit der FAST-POCT-Plattform. Die Elutionsreagenzien, magnetischen Mikrokügelchenreagenzien, Waschlösung A und Waschlösung W wurden zunächst in die Vorlagerkammern E, M, W1 bzw. W2 pipettiert. Die RNA-Adsorptionsschritte sind in Abb. 4a dargestellt und lauten wie folgt: (1) Die Probe wurde in die M-Kammer pipettiert und bei Anlegen des Drucks P1 (= 0,26 bar) in die Mischkammer abgegeben. (2) Der Luftdruck P2 (= 0,12 bar) wurde über Kanal A angelegt, der mit dem Boden der Mischkammer verbunden war. Obwohl viele Mischtechniken ihr Potenzial für das Mischen von Flüssigkeiten in den POCT-Plattformen zeigen (z. B. Serpentinenmischen53, chaotisches Mischen54 und Batch-Modus-Mischen55), sind ihre Mischeffizienz und -effektivität immer noch unbefriedigend. Hier kommt ein Blasenmischverfahren zum Einsatz, bei dem Luft in den Boden der Mischkammer eingeleitet wird, wodurch Luftblasen in der Flüssigkeit entstehen. Der starke Wirbel ermöglicht dann die volle Mischleistung innerhalb weniger Sekunden. Die Blasenmischungsexperimente wurden durchgeführt und die Ergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung S6 dargestellt. Es ist ersichtlich, dass es bei Anwendung eines Drucks von 0,10 bar etwa 8 s dauerte, bis eine vollständige Durchmischung abgeschlossen war. Als der Druck auf 0,20 bar anstieg, dauerte es nur etwa 2 s, bis eine vollständige Durchmischung erreicht war. Die Methode zur Berechnung der Mischeffizienz finden Sie im Abschnitt „Methode“. (3) Ein Rubidiummagnet wurde zum Extrahieren der Mikrokügelchen verwendet, gefolgt von einem Druck P3 (= 0,17 bar) durch den P-Kanal, um die Reagenzien in die Abfallkammer zu übertragen. Abbildung 4b, c zeigt die Waschschritte, die durchgeführt wurden, um die Verunreinigungen aus der Probe zu entfernen, wie folgt: (1) Die Waschlösung A aus der W1-Kammer wurde unter Verwendung des Drucks P1 in die Mischkammer abgegeben. (2) Anschließend wurde der Blasenmischvorgang durchgeführt. (3) Die Waschlösung A wurde in die Abfallkammer überführt, wobei die Mikrokügelchen in der Mischkammer durch den Magneten extrahiert wurden. Der Waschvorgang W (Abb. 4c) ähnelt dem Waschvorgang A (Abb. 4b). Es ist zu beachten, dass jeder Schritt zum Waschen A und W zweimal durchgeführt wurde. Abbildung 4d zeigt den Elutionsschritt, bei dem die RNA aus den Mikrokügelchen eluiert wird; Die Elutionsinjektions- und Mischschritte sind die gleichen wie die oben genannten RNA-Adsorptions- und Waschschritte. Da das Elutionsreagenz in die PCR-Reaktionskammer überführt wurde, wurde gleichzeitig der Druck P3 und P4 (= 0,23 bar) angelegt, wodurch der kritische Druck des Hebels zur Abdichtung der PCR-Reaktionskammer erreicht wurde. Ebenso trägt der Druck P4 auch dazu bei, den Kanal abzudichten, der zur Abfallkammer führt. Somit wurden alle Elutionsreagenzien gleichmäßig auf die vier PCR-Reaktionskammern verteilt, um eine Multiplex-PCR-Reaktion auszulösen. Der oben genannte Prozess wird im Supplementary Movie S6 bereitgestellt.

In einem RNA-Adsorptionsschritt wird die Probe in den M-Einlass eingeführt und zusammen mit der vorgelagerten Mikrokügelchenlösung in die Mischkammer injiziert. Nach dem Mischen und der Perlenextraktion wird das Reagenz in die Abfallkammer abgegeben. b, c Waschschritt: Verschiedene vorgelagerte Waschreagenzien werden in die Mischkammer injiziert und nach dem Mischen und der Perlenextraktion werden die Reagenzien in die Abfallkammer überführt. d Elutionsschritt: Das Elutionsreagenz wird injiziert und nach dem Mischen und der Perlenextraktion wird das Reagenz in die PCR-Reaktionskammer überführt. Die Kurven zeigen den Arbeitsprozess und die damit verbundenen Parameter in verschiedenen Schritten. Der Druck ist der durch verschiedene Kammern ausgeübte Druck. Das Volumen ist das Volumen der Flüssigkeit in der Mischkammer. Alle Maßstabsbalken sind 1 cm groß. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Der PCR-Testprozess wird durchgeführt und das thermische Profil ist in der ergänzenden Abbildung S7 dargestellt, einschließlich der Reverse-Transkriptionszeit von 20 Minuten und der Thermozykluszeit (95 und 60 °C) von 60 Minuten, mit einem Thermozyklus für 90 s (Ergänzung). Film S7). FAST-POCT benötigt weniger Zeit für die Durchführung eines Thermozyklus (90 s) als die herkömmliche RT-PCR (180 s für einen Thermozyklus). Dies ist auf das hohe Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis und die geringe thermische Trägheit der Mikro-PCR-Reaktionskammer zurückzuführen. Die Kammeroberfläche beträgt 96,6 mm2 und das Kammervolumen beträgt 25 mm3, sodass das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen etwa 3,86 beträgt. In der ergänzenden Abbildung S10 ist zu sehen, dass sich auf der Rückseite des PCR-Testbereichs unserer Plattform eine Rille befindet, wodurch die Bodendicke der PCR-Kammer 200 μm beträgt. Auf der Heizfläche des Temperiergeräts ist ein wärmeübertragendes elastisches Polster aufgeklebt, das für einen engen Kontakt mit der Rückseite der Prüfkammer sorgt. Auf diese Weise kann die thermische Trägheit der Plattform verringert und die Heiz-/Kühleffizienz erhöht werden. Während des Thermocycling-Prozesses schmolz das in der Plattform eingebettete Paraffinwachs und floss in die PCR-Reaktionskammer, wo es als Dichtungssubstanz fungierte, um die Verdunstung von Reagenzien und eine Kontamination der Umgebung zu verhindern (siehe Zusatzfilm S8).

Alle oben genannten PCR-Testprozesse wurden mithilfe eines maßgeschneiderten FAST-POCT-Instruments vollständig automatisiert, das aus einer programmierten Druckkontrolleinheit, einer magnetischen Extraktionseinheit, einer Temperaturkontrolleinheit und einer Einheit zur Erfassung und Verarbeitung von Fluoreszenzsignalen besteht. Es ist zu beachten, dass wir die FAST-POCT-Plattform für die RNA-Extraktion verwendet haben und dann die extrahierten RNA-Proben verwendet haben, um PCR-Reaktionen unter Verwendung des FAST-POCT-Systems und des Tisch-PCR-Systems zum Vergleich durchzuführen. Die Ergebnisse sind nahezu identisch, wie in der ergänzenden Abbildung S8 dargestellt. Der Bediener führt die einfache Aufgabe aus, die Probe in die M-Kammer zu injizieren und die Plattform auf das Instrument einzusetzen. Die quantitativen Testergebnisse liegen dann nach ca. 82 Minuten vor. Detaillierte Informationen zum FAST-POCT-Instrument finden Sie in den ergänzenden Abbildungen. S9, S10 und S11.

Die durch die Influenzaviren A (IAV), B (IBV), C (ICV) und D (IDV) verursachte Grippe ist ein weit verbreitetes globales Phänomen. Unter diesen sind IAV und IBV für die meisten Fälle schwerer Erkrankungen sowie saisonaler Epidemien verantwortlich, die 5–15 % der Weltbevölkerung infizieren, 3–5 Millionen Fälle schwerer Erkrankungen verursachen und jedes Jahr 290.000–650.000 Todesfälle verursachen Atemwegserkrankungen56,57. Eine frühzeitige Diagnose von IAV und IBV ist entscheidend für die Reduzierung der Morbidität und der damit verbundenen wirtschaftlichen Belastungen. Unter den verfügbaren Diagnosetechniken gilt die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) als die empfindlichste, spezifischste und genaueste (>99 %)58,59. Herkömmliche RT-PCR-Techniken erfordern jedoch mehrere Pipettier-, Misch-, Dosier- und Flüssigkeitsübertragungsvorgänge, was den Zugang für Fachpersonal in ressourcenbeschränkten Umgebungen einschränkt. Hier wurde die FAST-POCT-Plattform für getrennte PCR-Tests von IAV und IBV eingesetzt, um deren untere Nachweisgrenze (LOD) zu ermitteln. Darüber hinaus wurden Multiplex-Tests von IAV und IBV durchgeführt, um verschiedene Pathotypen einer Art zu unterscheiden und so eine vielversprechende genetische Analyseplattform und eine Möglichkeit für eine genaue Behandlung von Krankheiten bereitzustellen.

Abbildung 5a zeigt die PCR-Testergebnisse für IAV unter Verwendung von 150 μl gereinigter viraler RNA als Proben. Abbildung 5a(i) zeigt, dass bei einer IAV-Konzentration von 106 Kopien/ml die Fluoreszenzintensität (ΔRn) 0,830 betragen kann, und wenn die Konzentration auf 102 Kopien/ml abnimmt, kann ΔRn immer noch bis zu 0,365 betragen etwa 100-fach höher als der der leeren Negativkontrollgruppe (0,002). Für die quantitative Analyse wurde eine lineare Kalibrierungskurve zwischen der logarithmischen IAV-Konzentration und der Zyklusschwelle (Ct) mit R2 = 0,993 im Bereich von 102–106 Kopien/ml basierend auf sechs separaten Experimenten erhalten (Abb. 5a(ii)). . Diese Ergebnisse stimmen gut mit den herkömmlichen RT-PCR-Techniken überein. Abbildung 5a(iii) zeigt die Fluoreszenzbilder der Testergebnisse nach 40 Zyklen von der FAST-POCT-Plattform. Wir haben festgestellt, dass die FAST-POCT-Plattform nur 102 Kopien/ml IAV erkennen kann. Bei der herkömmlichen Methode gibt es jedoch keinen Ct-Wert bei einer Konzentration von 102 Kopien/ml, so dass der LOD bei etwa 103 Kopien/ml liegt. Wir gehen davon aus, dass dies auf die hohe Effizienz der Blasenmischung zurückzuführen ist. Die PCR-Testexperimente für gereinigte IAV-RNAs wurden durchgeführt, um verschiedene Mischmethoden zu bewerten, einschließlich Schüttelmischen (dieselbe Mischmethode wie beim herkömmlichen RT-PCR-Vorgang), Blasenmischen (die vorliegende Methode, 3 s bei einem Druck von 0,12 bar) und ohne Vermischung als Kontrollgruppe. Die Ergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung S12 zu finden. Es ist ersichtlich, dass bei hoher RNA-Konzentration (106 Kopien/ml) der Ct-Wert für verschiedene Mischmethoden fast derselbe ist wie der Ct-Wert beim Blasenmischen. Da die RNA-Konzentration auf 102 Kopien/ml sinkt, weisen die Schüttelmisch- und die Kontrollgruppe keinen Ct-Wert auf, während die Blasenmischmethode immer noch einen Ct-Wert von 36,9 erhält, was unter dem Ct-Schwellenwert von 38 liegt. Die Ergebnisse zeigen den Vorteil der Blasenmischung, was auch in anderer Literatur60 gezeigt wird und möglicherweise auch den Grund dafür erklärt, warum die FAST-POCT-Plattform eine etwas höhere Empfindlichkeit aufweist als die herkömmliche RT-PCR. Abbildung 5b zeigt die PCR-Testergebnisse für gereinigte IBV-RNA-Proben mit einer Konzentration im Bereich von 101 bis 106 Kopien/ml. Die Ergebnisse ähneln denen des IAV-Tests, der R2 = 0,994 und einen LOD von 102 Kopien/ml erreichte.

a PCR-Testergebnisse für Influenza-A-Virus (IAV) mit einer IAV-Konzentration im Bereich von 106 bis 101 Kopien/ml unter Verwendung von TE-Puffer als Negativkontrolle (NC). (i) Echtzeit-Fluoreszenzprofil. (ii) Die lineare Kalibrierungskurve zwischen der logarithmischen Konzentration der IAV-RNA und dem Zyklusschwellenwert (Ct) sowohl für FAST als auch für konventionelle Testtechniken. (iii) Fluoreszenzbilder von FAST-POCT mit IAV nach 40 Zyklen. b, PCR-Testergebnisse für das Influenza-B-Virus (IBV) mit (i) Echtzeit-Fluoreszenzprofil. (ii) die lineare Kalibrierungskurve und (iii) Fluoreszenzbilder von FAST-POCT mit IBV nach 40 Zyklen. Die untere Nachweisgrenze (LOD) für IAV und IBV mit der FAST-POCT-Plattform liegt bei 102 Kopien/ml und ist damit niedriger als bei herkömmlichen Methoden (103 Kopien/ml). c Mehrere Nachweisergebnisse für IAV und IBV. GAPDH wurde als Positivkontrolle und der TE-Puffer als Negativkontrolle verwendet, um eine mögliche Kontamination und Hintergrundverstärkung zu verhindern. Es können vier verschiedene Arten von Proben identifiziert werden: (1) negative Probe („IAV-/IBV-“) nur mit GAPDH; (2) IAV-infiziert („IAV+/IBV−“) mit IAV und GAPDH; (3) IBV-infiziert („IAV-/IBV+“) mit IBV und GAPDH; (4) IAV/IBV-infiziert („IAV+/IBV+“) mit IAV, IBV und GAPDH. Die gestrichelten Linien bezeichnen die Schwellenlinie. n = 6 biologisch unabhängige Experimente wurden mit den als ± sd angezeigten Daten durchgeführt. Die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Abbildung 5c ​​zeigt die Multiplex-Testergebnisse für IAV/IBV. Hier wurden die Viruslysate als Probenlösung anstelle der gereinigten RNAs verwendet, wobei vier Primer, die auf IAV, IBV, GAPDH (Positivkontrolle) und TE-Puffer (Negativkontrolle) abzielten, den vier verschiedenen Reaktionskammern des FAST-POCT hinzugefügt wurden Plattform. Die hier verwendete Positiv- und Negativkontrolle soll mögliche Kontaminationen und Hintergrundverstärkungen verhindern. Die Tests wurden in vier Gruppen eingeteilt: (1) negative Probe („IAV−/IBV−“) nur mit GAPDH; (2) IAV-infiziert („IAV+/IBV−“) mit IAV und GAPDH; (3) IBV-infiziert („IAV−/IBV+“) mit IBV und GAPDH; (4) IAV/IBV-infiziert („IAV+/IBV+“) mit IAV, IBV und GAPDH. Abbildung 5c ​​zeigt, dass bei Anwendung einer negativen Probe die Positivkontrollkammer eine Fluoreszenzintensität ΔRn von 0,860 aufwies, wobei der ΔRn von IAV und IBV dem der Negativkontrolle (0,002) ähnelte. Für die Gruppen IAV+/IBV−, IAV−/IBV+ und IAV+/IBV+ zeigten die Kammern IAV/GAPDH, IBV/GAPDH und IAV/IBV/GAPDH jeweils eine signifikante Fluoreszenzintensität, während andere Kammern sogar Fluoreszenzintensitäten auf Hintergrundniveau zeigten nach 40 Thermozyklen. Aus den oben genannten Tests geht hervor, dass die FAST-POCT-Plattform eine herausragende Spezifität aufweist und es uns ermöglicht, verschiedene Influenzaviren gleichzeitig zu pathotypisieren.

Um die klinische Anwendbarkeit von FAST-POCT zu validieren, haben wir 36 klinische Proben (Nasenabstrichproben) von Patienten (n = 18) mit IBV und Kontrollpersonen (n = 18) ohne IBV getestet (Abb. 6a). Patienteninformationen finden Sie in der Ergänzungstabelle 3. Der IBV-Infektionsstatus wurde unabhängig bestätigt und die Studienprotokolle wurden vom First Affiliated Hospital der Zhejiang University (Hangzhou, Zhejiang) genehmigt. Jede Patientenprobe wurde in zwei Kategorien unterteilt. Ein Aliquot wurde mit dem FAST-POCT und das andere mit einem Tisch-PCR-System (SLAN-96P, China) verarbeitet. Für beide Tests wurden dieselben Reinigungs- und Testkits verwendet. Abbildung 6b zeigt die Ergebnisse von FAST-POCT und konventioneller PCR mit reverser Transkription (RT-PCR). Wir verglichen die Fluoreszenzintensität (FAST-POCT) mit −log2(Ct), wobei Ct der Zyklus-Cut-off der herkömmlichen RT-PCR ist. Es wurde eine gute Übereinstimmung zwischen diesen beiden Methoden beobachtet. FAST-POCT und RT-PCR zeigten eine starke positive Korrelation mit den Pearson-Koeffizienten (r)-Werten von 0,90 (Abb. 6b). Als nächstes beurteilten wir die diagnostische Genauigkeit von FAST-POCT. Als unabhängige Analysemaße wird die Fluoreszenzintensitätsverteilung (FL) sowohl für positive als auch für negative Proben bereitgestellt (Abb. 6c). Die FL-Werte waren bei Patienten mit IBV signifikant höher (****P = 3,31 × 10−19; zweiseitiger t-Test) als bei Patienten in Kontrollgruppen (Abb. 6d). Für IBV wurden weiterhin ROC-Kurven (Receiver Operating Characteristic) erstellt. Wir fanden, dass die diagnostische Genauigkeit ausgezeichnet war, mit einer Fläche unter der Kurve von 1 (Abb. 6e). Bitte beachten Sie, dass wir aufgrund der seit 2020 in China aufgrund von COVID-19 geltenden Maskenpflicht keine Patienten mit IAV gefunden haben; Daher sind alle positiven klinischen Proben (dh Nasenabstrichproben) nur für IBV bestimmt.

a Klinisches Studiendesign. Insgesamt 36 Proben wurden mit der FAST-POCT-Plattform und konventioneller RT-PCR analysiert, darunter 18 Patientenproben und 18 Kontrollpersonen ohne Influenza. b Bewertung der analytischen Übereinstimmung zwischen FAST-POCT-PCR und konventioneller RT-PCR. Die Ergebnisse waren positiv korreliert (Pearson's r = 0,90). c Fluoreszenzintensitätsniveaus für 18 Patienten mit IBV und 18 Kontrollpersonen. d FL-Werte waren bei den Patienten mit IBV (+) signifikant höher als bei den Kontrollpersonen (−) (****P = 3,31 × 10−19; zweiseitiger t-Test; n = 36). Für jedes Boxdiagramm gibt die mittlere schwarze Markierung den Median an, und die untere und obere Linie der Box geben das 25. bzw. 75. Perzentil an. Die Whisker erstrecken sich auf die Min-Max-Datenpunkte, die nicht als Ausreißer galten. e ROC-Kurven. Die gepunktete Linie d bezeichnet den aus der ROC-Analyse geschätzten Cutoff. Die AUC für IBV betrug 1. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

In diesem Artikel haben wir ein FAST demonstriert, das die gewünschten Eigenschaften für einen idealen POCT besitzt. Zu den Vorteilen unserer Technologie gehören: (1) multifunktionale Abgabe (kaskadiert, gleichzeitig, sequentiell und selektiv), bedarfsgesteuerte Abgabe (schnelle und proportionale Abgabe zum angelegten Druck) und robuster Betrieb (ohne Leckage unter der Vibration von 150). rad/min); (2) Langzeitlagerung (beschleunigte Lebensdauertests von 2 Jahren mit etwa 0,3 % Gewichtsverlust); (3) Fähigkeit, Flüssigkeiten mit einem weiten Bereich an Benetzbarkeit und Viskosität zu handhaben (Viskosität bis zu 5500 cp); (4) Kosteneffizienz (die geschätzten Materialkosten für das FAST-POCT-PCR-Gerät betragen etwa 1 US-Dollar). Durch die Kombination der multifunktionalen Abgabeeinheiten wurde eine integrierte FAST-POCT-Plattform demonstriert und auf PCR-Tests von Influenza-A- und -B-Viren angewendet. IAV und IBV können in situ mit 102 Kopien/ml LOD nachgewiesen werden, und die einstufige Pathotypisierung von IAV und IBV auf der FAST-POCT-Plattform wurde in 82 Minuten erreicht. Die klinischen Tests mit 36 ​​Nasenabstrichproben zeigten eine gute Übereinstimmung der Fluoreszenzintensität mit der Standard-RT-PCR (Pearson-Koeffizienten > 0,9). Parallel zu dieser Arbeit haben verschiedene neue biochemische Techniken (z. B. plasmonische Thermozyklustests, amplifikationsfreie Immunoassays und Nanokörper-funktionalisierte Tests) ihr Potenzial für POCT gezeigt. Aufgrund des Fehlens einer vollständig integrierten und robusten POCT-Plattform erfordern diese Techniken jedoch zwangsläufig separate Vorbehandlungsprozesse (z. B. RNA-Extraktion44, Inkubation45 und Spülung46), wodurch die vorliegende Arbeit diese Technologien noch weiter ergänzt, um Fortschritte zu erzielen POCT-Funktionen mit gewünschter „Sample-in-Antwort-out“-Leistung. Obwohl in dieser Arbeit eine pneumatische Pumpe, die zur Aktivierung der FAST-Ventile verwendet wird, klein ist und in ein Tischgerät integriert werden kann (Abb. S9, S10), verbraucht sie dennoch beträchtliche Energie und macht Geräusche. Grundsätzlich kann die pneumatische Pumpe durch andere Mittel mit kleinerem Formfaktor ersetzt werden, beispielsweise durch die Verwendung einer elektromagnetischen Kraft oder fingerbetätigter Kräfte. Weitere Verbesserungen können beispielsweise die kundenspezifische Anpassung der Kartusche für verschiedene und spezifische biochemische Tests und die Einführung neuartiger Nachweismethoden sein, die kein Heiz-/Kühlsystem erfordern, was zu einer instrumentenlosen POCT-Plattform für PCR-Anwendungen führt. Wir glauben, dass die vorgeschlagene FAST-Technik das Potenzial zur Schaffung einer universellen Plattform nicht nur für biomedizinische Tests, sondern auch für Umweltüberwachung, Lebensmittelqualitätsprüfung, Materialsynthese und Pharmazeutika darstellt, da die FAST-Plattform ein Mittel zur Manipulation von Flüssigkeiten bietet.

Die Entnahme und Verwendung menschlicher Nasenabstrichproben wurde von der Ethikkommission des First Affiliated Hospital der Zhejiang University (IIT20220330B) genehmigt. Es wurden 36 Nasenabstrichproben entnommen, darunter 16 Erwachsene < 30 Jahre, 7 Erwachsene > 40 Jahre sowie 19 Männer und 17 Frauen. Die demografischen Daten sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt. Die Einverständniserklärung aller Teilnehmer wurde eingeholt. Bei den Teilnehmern handelt es sich ausschließlich um Personen mit Grippeverdacht, die sich freiwillig und ohne Entschädigung bereit erklärten, sich testen zu lassen.

Das Substrat und die Abdeckung von FAST bestanden aus Polymilchsäure (PLA)-Materialien und wurden mit einem Ender 3 Pro 3D-Drucker (Shenzhen Creality 3D Technology Co. Ltd.) 3D-gedruckt. Der doppelseitige Klebstoff wurde von Adhesives Research, Inc. gekauft und der Modus ist 90880. Die 100 μm dicke PET-Folie wurde von McMaster-Carr gekauft. Die Klebstoffe und PET-Folien wurden beide mit einem Silhouette Cameo 2-Schneidegerät von Silhouette America, Inc. geschnitten. Die elastische Folie wurde aus PDMS-Material im Formgussverfahren hergestellt. Zunächst wurde ein PET-Rahmen mit einer Dicke von 200 μm mit einem Lasersystem geschnitten und mit doppelseitigen Klebebändern mit einer Dicke von 100 μm auf eine 3 mm dicke PMMA-Platte geklebt. Dann wurde ein PDMS-Vorläufer (Sylgard 184; Teil A:Teil B = 10:1, Dow Corning) in die Form gegossen und überschüssiges PDMS mit einem Glasstab entfernt. Nach einer dreistündigen Aushärtung bei 70 °C kann der PDMS-Film mit einer Dicke von 300 μm von der Form abgezogen werden.

Die Bilder der Multifunktionsausgabe, der On-Demand-Auslösung und des robusten Betriebs wurden alle mit einer Hochgeschwindigkeitskamera (Sony AX700 mit 1000 Bildern pro Sekunde) aufgenommen. Der in den Robustheitstests verwendete Orbitalschüttler wurde von SCILOGEX (SCI-O180) erworben. Zur Erzeugung des Luftdrucks kam ein Luftkompressor zum Einsatz, zur Einstellung des Druckwertes kamen mehrere digitale Präzisionsdruckregler zum Einsatz. Der Prozess zum Testen des Fließverhaltens ist der folgende. Eine vorgegebene Flüssigkeitsmenge wurde in das Prüfgerät eingespritzt und mit einer Hochgeschwindigkeitskamera das Fließverhalten aufgezeichnet. Die Standbilder wurden dann zu festgelegten Zeitpunkten aus dem Strömungsverhaltensvideo aufgenommen und die verbleibende Fläche mit der Software Image-Pro Plus berechnet und dann mit der Tiefe der Kammer multipliziert, um das Volumen zu berechnen. Einzelheiten zum Fließverhaltenstestsystem finden Sie in der ergänzenden Abbildung S4.

50 μl Mikrokügelchen und 100 μl entionisiertes Wasser wurden in ein Blasenmischgerät injiziert. Die Bilder der Mischleistung wurden alle 0,1 s mit einer Hochgeschwindigkeitskamera aufgenommen, wobei der Druck zwischen 0,1 bar, 0,15 bar bzw. 0,2 bar variierte. Die Pixelinformationen beim Mischen können aus diesen Bildern mit einer Fotobearbeitungssoftware (Photoshop CS6) gewonnen werden. Und die Mischeffizienz kann mit der folgenden Gleichung53 erreicht werden.

Dabei ist M die Mischeffizienz, N die Gesamtzahl der Probenpixelpunkte, ci und \(\bar{c}\) die normalisierte Konzentration und die erwartete normalisierte Konzentration. Die Mischeffizienz reicht von 0 (0 %, nicht mischen) bis 1 (100 %, vollständig gemischt). Die Ergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung S6 dargestellt.

Das IAV- und IBV-Echtzeit-RT-PCR-Kit enthält die IAV- und IBV-RNA-Probe (Katalognummer: RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, China), den Tris-EDTA-Puffer (TE-Puffer, Katalognummer: B541019, Sangon Biotech, China), das RNA-Reinigungskit (Katalognummer: Z-ME-0010, Liferiver, China) und die GAPDH-Lösung (Katalognummer: M591101, Sangon Biotech, China) für die Positivkontrolle sind alle kommerziell erhältlich. Das RNA-Reinigungskit enthält Bindungspufferlösung, Waschmittel A, Waschmittel W, Elutionslösung, magnetische Mikrokügelchen und AcrylCarrier. Das IAV- und IBV-Echtzeit-RT-PCR-Kit enthält eine IFVA-Nukleinsäure-Fluoreszenz-PCR-Testmischung und ein RT-PCR-Enzym. 6 μl AcrylCarrier und 20 μl magnetische Mikrokügelchen wurden zu der 500 μl Bindungspufferlösung gegeben, die geschüttelt wurde, und anschließend wurde die Mikrokügelchenlösung erhalten. 21 ml Ethanol wurden zu den Waschlösungen A und W gegeben und geschüttelt, woraufhin die Waschlösungen A bzw. W erhalten wurden. Anschließend wurden 18 μl IFVA-Nukleinsäure-Fluoreszenz-PCR-Testmischung und 1 μl RT-PCR-Enzym zu der 1 μl TE-Lösung gegeben, die mehrere Sekunden lang geschüttelt und zentrifugiert wurde, wodurch die 20 μl Primer sowohl für IAV als auch für IBV hergestellt wurden.

Der folgende RNA-Reinigungsprozess wurde befolgt: (1) RNA-Adsorption. 526 μl Mikrokügelchenlösung wurden in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen pipettiert, zu dem 150 μl Probe gegeben wurden; Anschließend wurde das Röhrchen zehnmal manuell auf und ab geschüttelt. Die 676 μl-Mischung wurde auf die Affinitätssäule übertragen, wo sie 60 s lang mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 1,88 × 104 g zentrifugiert wurde. Die anschließende Abfalllösung wurde dann aufgegeben. (2) Waschschritt eins. 500 μl Waschlösung A wurden auf die Affinitätssäule gegeben; Die Zentrifugation erfolgte 40 s lang mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 1,88 × 104 g und die Abfalllösung wurde anschließend aufgegeben. Dieser Waschvorgang wurde zweimal wiederholt. (3) Waschschritt zwei. 500 μl Waschlösung W wurden auf die Affinitätssäule gegeben, anschließend 15 s lang mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 1,88 × 104 g zentrifugiert und anschließend die Abfalllösung aufgegeben. Dieser Waschvorgang wurde zweimal wiederholt. (4) Elution. 200 μl Elutionslösung wurden zur Affinitätssäule gegeben und anschließend 2 Minuten lang mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 1,88 × 104 g zentrifugiert. (5) RT-PCR: Elutionslösung wurde zu 20 μl Primerlösung im PCR-Röhrchen hinzugefügt; Das Röhrchen wurde dann in ein Echtzeit-PCR-Testgerät (SLAN-96P) gegeben, um den RT-PCR-Prozess durchzuführen. Der gesamte Testprozess dauerte etwa 140 Minuten (die RNA-Reinigung dauerte 20 Minuten und der PCR-Test 120 Minuten).

526 μl Mikrokügelchenlösung, 1000 μl Waschlösung A, 1000 μl Waschlösung W, 200 μl Elutionslösung und 20 μl Primerlösungen wurden vorab zugegeben und in den Kammern M, W1, W2, E und anschließend in der PCR-Testkammer aufbewahrt Plattform montiert. Anschließend wurde die 150-μl-Probe in Kammer M pipettiert und die FAST-POCT-Plattform in das in der ergänzenden Abbildung S9 gezeigte Testgerät eingesetzt. Nach etwa 82 Minuten lagen die Testergebnisse vor.

Alle Testergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung nach mindestens sechsmaliger Wiederholung unter Verwendung separater FAST-POCT-Plattformen mit biologisch unabhängigen Proben dargestellt, sofern nicht anders angegeben. Es wurden keine Daten von den Analysen ausgeschlossen. Die Experimente waren nicht randomisiert. Der Forscher war während des Experiments hinsichtlich der Gruppenzuordnung nicht blind.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind unter „Supplementary Information“ verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

CL und HJ danken Vantronics LLC und Dr. Jun Fan vom First Affiliated Hospital der Zhejiang University (Hangzhou, Zhejiang) für die Unterstützung bei der Probenentnahme und unabhängigen Überprüfung. Einige der experimentellen Arbeiten wurden in den Einrichtungen der Arizona State University durchgeführt, als CL und HJ dort waren. HJ dankt der Westlake University für ihre Unterstützung.

School of Engineering, Westlake University, Hangzhou, 310024, China

Chao Liang und Hanqing Jiang

Vantronics Hangzhou Intelligence Technology Ltd., Hangzhou, 311100, China

Zihang Yang

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CL und HJ haben die Experimente entworfen. CL und ZY führten Experimente und Analysen durch. CL und HJ führten eine theoretische Analyse durch und verfassten die Arbeit.

Korrespondenz mit Hanqing Jiang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Liang, C., Yang, Z. & Jiang, H. Eine durch Filmhebel betätigte Schaltertechnologie für die multifunktionale, bedarfsgerechte und robuste Handhabung von Flüssigkeiten. Nat Commun 13, 4902 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32676-4

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Eingegangen: 13. Dezember 2021

Angenommen: 11. August 2022

Veröffentlicht: 20. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32676-4

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